BioSolutions Halle GmbH

An-Institut der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg BioSolutions Halle GmbH, Weinbergweg 22, 06120 Halle

 

Dienstleistungen

Präklinische Substanzforschung
Leitung: Dr. Thomas Müller/ Dr. Wieland Voigt

Evaluierung des zytotoxischen Potentials von chemischen Substanzen an Tumorzelllinien

Bei der Entwicklung neuer wirksamer Tumortherapeutika ist die Evaluierung des zytotoxischen Potentials ausgewählter Substanzen, die als Therapeutika in Frage kommen könnten, ein wichtiger Schritt am Beginn der Medikamentenentwicklung.
Wir bieten die Testung von neuen oder modifizierten Substanzen an verschiedenen Tumorzelllinien an, um festzustellen,

a) ob eine prinzipielle Wirksamkeit vorliegt, (z.b. bei grundlegend neuen, noch nicht getesteten Substanzen)

oder

b) welchen Einfluss Strukturvariationen bzw. -kombinationen bekannter Substanzen haben

Zelllinien, die für die in vitro Testung zur Verfügung stehen:

Probenform: Feststoffe, Flüssigkeiten, Substanz abgewogen in Tube, Angaben zur Löslichkeit

Probenmenge: 10 mg Mindestmenge

Genaue Methodenbeschreibung

Leistungen:

1. Zytotoxizitätsassay
3 Testreihen pro Substanz und Zellinie Diagramme zu den Konzentrations-Wirkungsbeziehungen IC50 Werte als Mittelwerte plus/minus Standardabweichung Kurzauswertung
2. Apoptosenachweis
Trypanblau-Test mit Mikroskop-Aufnahme und Kurzauswertung
DNA-Laddering mit Bild und Kurzauswertung

3. Publikationsreife Auswertung der Testergebnisse nach Absprache mit dem Auftraggeber

Ansprechpartner:

Dr. Reinhard Paschke

e-mail:	info@biosolutions-halle.de
Tel.:	++49 - 345 - 55 21 600
Fax:	++49 - 345 - 55 59 669
Anschrift:	BioSolutions Halle GmbH Weinbergweg 22 06120 Halle
homepage:	www.biosolutions-halle.de

Literatur:

(1) Cornelia Vetter, Christoph Wagner, Goran N. Kaluderovic´, Reinhard Paschke, Dirk Steinborn; Synthesis, characterization, and cytotoxicity of trimethylplatinum(IV) complexes with 2-thiocytosine and 1-methyl-2-thiocytosine ligands; Inorganica Chimica Acta 362 (2009) 189–195

(2) Goran N. Kaluderovic, Harry Schmidt, Sebastian Schwieger, Christoph Wagner, Reinhard Paschke, Andrea Dietrich,Thomas Mueller, and Dirk Steinborn; Platinum(IV) complexes with ethylenediamine-N,N´-diacetate dieser (R2edda) ligands: synthesis, characterization and in vitro antitumoral activity, INORGANICA CHIMICA ACTA, 361, (2008), 1395-1404

(3) Ronald Lindner, Goran N. Kaluderovic, Reinhard Paschke, Christoph Wagner, Dirk Steinborn; Synthesis and characterisation of dinuclear µ-pyrazolato-platinum(IV) complexes; (2008), Polyhedron, 27, 914–922

(4) Kaluderovic, G. N.; Schmidt, H.; Paschke, R.; Kalinowski, B.; Dietrich, A.; Mueller, T.; Steinborn, D.; Platinum(II) complexes with -methionylglycine and -methionyl--leucine ligands: Synthesis, characterization and in vitro antitumoral activity; Journal of Inorganic Biochemistry (2007), 101(3), 543-549

(5) Dietrich, A., Mueller, T., Paschke, R., Kalinowski, B., Behlendorf, T., Reipsch, F., Fruehauf, A., Schmoll, H. J., Kloft, C., and Voigt, W. (2008). 2-(4-(Tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)-undecyl)-propane-1,3-diamminedichloropl atinum(II): a novel platinum compound that overcomes cisplatin resistance and induces apoptosis by mechanisms different from that of cisplatin. J Med Chem 51, 5413-5422.

(6) Mueller, T., Voigt, W., Simon, H., Fruehauf, A., Bulankin, A., Grothey, A., and Schmoll, H. J. (2003). Failure of activation of caspase-9 induces a higher threshold for apoptosis and cisplatin resistance in testicular cancer. Cancer Res 63, 513-521.

(7) Paschke, R., Kalbitz, J., Paetz, C., Luckner, M., Mueller, T., Schmoll, H. J., Mueller, H., Sorkau, E., and Sinn, E. (2003). Cholic acid-carboplatin compounds (CarboChAPt) as models for specific drug delivery: synthesis of novel carboplatin analogous derivatives and comparison of the cytotoxic properties with corresponding cisplatin compounds. J Inorg Biochem 94, 335-342.

(8) Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S., and Boyd, M. R. (1990). New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancer Inst 82, 1107-1112.

(9) Voigt, W. (2005). Sulforhodamine B assay and chemosensitivity. Methods Mol Med 110, 39-48.

Methode/Vorgehen:

Zur in vitro Testung von Substanzen stehen Zelllinien aus folgenden Tumorentitäten zur Verfügung:
8x Kolorektales Karzinom, 4x Keimzelltumor, 4x Lungenkarzinom, 4x Schilddrüsenkarzinom, 2x Brustkarzinom, 2x Kopf-Hals Karzinom, 2x Neuroblastom, 1x Melanom, 1x Zervixkarzinom, 1x Glioblastom, 1x Hepatom, 1x Ovarialkarzinom, 1x Prostatakarzinom.
Diese Zelllinien sind hinsichtlich des Wirkspektrums der für die jeweilige Tumorentität klinisch eingesetzten chemotherapeutischen Substanzen wie Cisplatin, Oxaliplatin, Irinotecan, 5-Fluorouracil, Doxorubicin, Paclitaxel oder Vincristin charakterisiert. Die Zelllinien können je nach Fragestellung ausgewählt werden (grundlegendes Screening oder spezielle Tumorentität).
Die Testung der Substanzen erfolgt mittels Sulforhodamin-B Zytotoxizitätsassay. Die Substanzen werden dabei in seriellen Verdünnungen eingesetzt. Zunächst wird der substanz-spezifische, wirksame Konzentrationsbereich bestimmt. Im Folgenden werden in diesem Bereich genaue Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen erstellt und auf dieser Grundlage die IC50 und IC90 mittels SigmaPlot ermittelt (IC- inhibitory concentration). Es werden 3 unabhängige Versuche durchgeführt und die IC-Werte als Mittelwerte plus/minus Standartabweichung angegeben. An Hand dieser IC-Werte, welche einen Konzentrationswert angeben, können verschiedene Substanzen direkt miteinander verglichen werden. Zusätzlich können als Vergleich zu der zu testenden Substanz klinisch etablierte Chemotherapeutika mit analysiert werden. Dabei können je nach Fragestellung verschiedene Chemotherapeutika in Betracht gezogen werden: (1) ein Chemotherapeutikum, welches zur Behandlung der durch die jeweilige Zelllinie repräsentierten Tumorentität klinisch eingesetzt wird, (2) ein Chemotherapeutikum, das bei der Synthese der zu untersuchenden Substanz als Basis verwendet wurde (bei Modifikationen von etablierten Chemotherapeutika), (3) ein Chemotherapeutikum derselben Klasse, falls diese für die neue Substanz bekannt ist oder postuliert werden kann (z.B. Platin-Analoga, Antimetabolite, Topoisomerasehemmer) (4) ein Chemotherapeutikum mit denselben primären zellulären Zielstrukturen, falls diese für die neue Substanz bekannt sind oder postuliert werden können (z.B. DNA, Tubulin), (5) ein Chemotherapeutikum mit Strukturähnlichkeit zu der zu untersuchenden Substanz, falls keinerlei Anhaltspunkte vorliegen.
Die Analyse des induzierten Zelltodes – Apoptose vs. Nekrose – erfolgt über den Trypanblau-Ausschlusstest und mittels DNA-Gelelektrophorese Dazu werden die Tumorzellen mit der jeweiligen IC90 behandelt und frisch abgestorbene Zellen auf deren Fähigkeit Trypanblau auszuschließen analysiert. Weiterhin werden derartige Zellen aufgeschlossen und die DNA der Agarosegelelektrophorese zugeführt. Apoptotische Zellen sind in der Lage, Trypanblau auszuschließen und deren DNA zeigt das spezifische DNA-Fragmentierungsmuster.

Beispiel:

Evaluierung des zytotoxischen Potentials eines neuen Cisplatin-Derivates im Vergleich zu Cisplatin

Diagramm der Konzentrations-Wirkungs-Beziehung:

Vergrößerte Ansicht des Diagramms im pdf-Format

Trypanblau - Ausschlusstest

Apoptose	Apoptose	Nekrose
Cisplatin	ChAPt-11

DNA-Laddering - Analyse des Apoptose-spezifischen DNA-Fragmentierungsmusters

Cisplatin

ChAPt-11

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